Описание изобретения к патенту - Медицинские препараты на основе декстрана
Изобретение относится к экспериментальной медицине и биологии, в частности к способу получения меченых полисахаридов, предназначенных для изучения транспорта биологически активных веществ через клеточные мембраны и изучения механизмов действия лекарственных препаратов на клеточном и субклеточном уровнях.
В экспериментальной медицине широко используются флуоресцентные производные полисахаридов, в частности декстрана, для изучения транспорта биологически активных веществ через клеточные мембраны. Особый интерес для фармакологии представляют окисленные декстраны, так как они обладают высокой биосовместимостью, иммуномодулирующей активностью и могут использоваться в качестве перспективной матрицы для иммобилизации биологически активных веществ с целью их адресной доставки в различные клетки-мишени. Окисленные декстраны представляют собой производные декстрана, полученные путем его химического или радиационного окисления и содержащие карбонильные группы. С помощью окисленных декстранов получены перспективные лекарственные композиции (конъюгаты) для лечения туберкулеза, системных микозов и вирусных заболеваний. Однако механизм действия окисленных декстранов до настоящего времени изучен недостаточно, так как отсутствуют способы получения их флуоресцентных производных. Основная проблема при создании указанных производных состоит в сохранении карбонильных групп, образующихся при окислении декстранов и обусловливающих их специфические биологические свойства.
Известен способ получения флуоресцентных производных полисахаридов, в частности декстрана, включающий получение G-, R - или F-производных декстрана; проведение реакции взаимодействия G-производного декстрана с флуоресцентным красителем, содержащим R-функциональную группу, или реакции R-производного декстрана с флуоресцентным красителем, содержащим G-функциональную группу, или реакции F-производного декстрана с флуоресцентным красителем, содержащим G-функциональную группу, и со связующим реагентом, например карбодиимидом; очистку флуоресцентного производного декстрана от примесей (свободного красителя и свободного декстрана) путем фильтрации и последующего хроматографического разделения, где R - реакционно-способные группы, например сукцинимидные группы, карбоксильные, изотиоцианатные, галогенацетамидные, малеимидные, азидные, альдегидо - и кетогруппы или сульфгидрильные группы, G и F - комплементарные функциональные группы, например карбоксильные, альдегидные, кето-, амино - или сульфгидрильные группы. Недостатком известного способа является его непригодность для получения флуоресцентных производных окисленных декстранов, т. к. это может привести к полной потере карбонильных групп, обусловливающих специфические биологические свойства окисленных декстранов.
Наиболее близким к заявленному является способ получения флуоресцентного производного декстрана, включающий активацию декстрана путем реакции с бромпропиламином, осаждение полученного аминопроизводного декстрана этанолом; очистку аминопроизводного декстрана диализом; проведение реакции аминопроизводного декстрана с 5-([4,6-дихлоротриазин-2-ил]амино)-флуоресцеином путем конденсации в буферном растворе; отделение полученного флуоресцентного производного декстрана от свободного 5-([4,6-дихлоротриазин-2-ил]амино)-флуоресцеина ультрафильтрацией, в частности, диализом; очистку флуоресцентного аминопроизводного декстрана путем хроматографического разделения.
Недостатком способа-прототипа является его непригодность для получения флуоресцентного производного окисленного декстрана. Это обусловлено тем, что активация окисленного декстрана бромпропиламином может привести к полной потере карбонильной емкости (карбонильных групп) окисленного декстрана, что также приведет к изменению его биологических свойств. Используемый в способе флуоресцентный краситель - 5-([4,6-дихлоротриазин-2-ил]амино)-флуоресцеин - также может реагировать с карбоксильными группами окисленного декстрана и изменять его биологические свойства. Кроме того, 5-([4,6-дихлоротриазин-2-ил]амино)-флуоресцеин обладает токсичностью, не является коммерческим продуктом, что требует дополнительных затрат на его синтез.
Задачей, на решение которой направлено изобретение, является получение флуоресцентного производного окисленного декстрана с сохранением в его составе карбонильных групп, обусловливающих его специфические биологические свойства, упрощение способа.
Поставленная техническая задача достигается тем, что в качестве производного декстрана используют окисленный декстран, в качестве флуоресцентного красителя используют флуоресцеин, в качестве активирующего реагента - 1,1-карбонилдиимидазол, активацию окисленного декстрана производят путем добавления 1,1-карбонилдиимидазола в реакционную смесь окисленного декстрана с флуоресцеином; при этом используют окисленный декстран с молекулярной массой 35-65 кДа, предварительно растворенный в боратном буферном растворе с рН 9,2-11,0; соотношение компонентов реакционной смеси флуоресцеин - окисленный декстран составляет 1:(110-120) в пересчете на массу сухого вещества; соотношение компонентов 1,1-карбонилдиимидазол - окисленный декстран составляет 1:(21,0-21,5) в пересчете на массу сухого вещества.
Описание сущности изобретения
Способ получения флуоресцентного производного декстрана включает проведение реакции окисленного декстрана с флуоресцеином, для активации окисленного декстрана в ходе проведения указанной реакции в реакционную смесь добавляют 1,1-карбонилдиимидазол, очистку целевого продукта от примесей осуществляют методом ультрафильтрации.
Для осуществления заявленного способа сухой окисленный декстран с молекулярной массой 35-65 кДа предварительно растворяют в боратном буферном растворе с рН 9,2-11,0 до концентрации 10%.
Флуоресцеин смешивают с полученным раствором окисленного декстрана в весовом соотношении 1:(110-120) из расчета на сухую массу веществ. Для запуска реакции в реакционную смесь добавляют 1,1-карбонилдиимидазол в качестве активирующего реагента в весовом соотношении с декстраном 1:(21,0-21,5) в пересчете на массу сухого вещества. 1,1-карбонилдиимидазол способствует взаимодействию окисленного декстрана с флуоресцеином путем активации гидроксильных групп окисленного декстрана. Реакцию проводят при слабом перемешивании при комнатной температуре в течение 18-24 часов.
Затем реакционную смесь очищают от низкомолекулярных компонентов реакционной смеси (непрореагировавших флуоресцеина и 1,1-карбонилдиимидазола, а также компонентов боратного буфера) методом ультрафильтрации в режиме диафильтрации с использованием в качестве растворителя воды на мембранах, позволяющих отсекать низкомолекулярные соединения с М. м. 10 кДа или 5 кДа. В результате получают очищенный раствор флуоресцентного производного окисленного декстрана. Примеси не содержат свободного окисленного декстрана, поскольку 1,1-карбонилдиимидазол реагирует с гидроксильными группами окисленного декстрана, которых не менее 5 на каждое глюкопиранозное кольцо, при этом флуоресцеин и 1,1-карбонилдиимидазол берутся в избытке в соответствии с указанными выше пропорциями.
Определяющим существенным отличием заявляемого способа от способа-прототипа является то, что для обеспечения взаимодействия с флуоресцеином активацию окисленного декстрана проводят с помощью 1,1-карбонилдиимидазола, который не вступает в реакцию с карбонильными группами окисленного декстрана, отвечающими за его биологические свойства. Используемый в заявленном способе флуоресцентный краситель флуоресцеин не обладает нежелательными побочными эффектами, является коммерческим продуктом, что в отличие от прототипа не требует дополнительных затрат на его синтез. Кроме того, заявленный способ содержит меньшее количество операций по очистке конечного продукта от примесей (не требуется хроматографического разделения). Все вышеуказанное делает его более простым в исполнении.
Примеры конкретного выполнения
Пример 1.
Сухой окисленный декстран с молекулярной массой 65 кДа растворяют в боратном буферном растворе с рН 9,2 до концентрации 10%. В 200 мл полученного 10%-ного раствора окисленного декстрана вносят навеску флуоресцеина массой 0,18 г и перемешивают смесь до полного растворения флуоресцеина (соотношение флуоресцеин - окисленный декстран - 1:110 в пересчете на массу сухого вещества). В полученный раствор вносят навеску 1,1-карбонилдиимидазола массой 0,930 г (соотношение 1,1'-карбонилдиимидазол - окисленный декстран равно 1:21,5 в пересчете на массу сухого вещества), реакционную смесь перемешивают и оставляют при комнатной температуре на 20 часов при слабом перемешивании. Затем проводят диафильтрацию на мембранном модуле Vivaflow 200 с отсекающей М. м. 10 кДа (активная мембранная поверхность 200 см2), используя в качестве замещающего раствора 4 л дистиллированной воды. Получают раствор флуоресцентного производного окисленного декстрана. Чистоту конечного продукта контролируют методом капиллярного электрофореза. Выход целевого продукта составляет 92% от расчетного значения.
Пример 2.
Сухой окисленный декстран с молекулярной массой 35 кДа растворяют в боратном буферном растворе с рН 11,0 до концентрации 10%. В 200 мл полученного 10%-ного раствора окисленного декстрана вносят навеску флуоресцеина массой 0,167 г (соотношение флуоресцеин - окисленный декстран - 1:120 в пересчете на сухое вещество) и перемешивают смесь до полного растворения флуоресцеина. В полученный раствор вносят навеску 1,1-карбонилдиимидазола массой 0,952 г (соотношение 1,1'-карбонилдиимидазол - окисленный декстран равно 1:21,0 в пересчете на массу сухого вещества), реакционную смесь перемешивают 10 минут и оставляют при комнатной температуре на 18 часов при слабом перемешивании. Затем проводят диафильтрацию на мембранном модуле Vivaflow 200 с отсекающей М. м. 5 кДа (активная мембранная поверхность 200 см2), используя в качестве замещающего раствора 3,5 л дистиллированной воды. Получают раствор флуоресцентного производного окисленного декстрана. Чистоту конечного продукта контролируют методом капиллярного электрофореза. Выход целевого продукта составляет 94% от расчетного значения.
Пример 3.
Сухой окисленный декстран с молекулярной массой 60 кДа растворяют в боратном буферном растворе с рН 10,0 до концентрации 10%. В 200 мл 10%-ного раствора окисленного декстрана вносят навеску флуоресцеина массой 0,174 г (соотношение флуоресцеин - окисленный декстран - 1:114,9 в пересчете на сухое вещество) и перемешивают смесь до полного растворения флуоресцеина. В полученный раствор вносят навеску 1,1- карбонилдиимидазола массой 0,937 г (соотношение 1,1- карбонилдиимидазол - окисленный декстран равно 1:21,3 в пересчете на массу сухого вещества), реакционную смесь перемешивают 10 минут и оставляют при комнатной температуре на 24 часа при слабом перемешивании. Затем проводят диафильтрацию на мембранном модуле Vivaflow 200 с отсекающей М. м. 5 кДа (активная мембранная поверхность 200 см2), используя в качестве замещающего раствора 3,5 л дистиллированной воды. Получают раствор флуоресцентного производного окисленного декстрана. Чистоту конечного продукта контролируют методом капиллярного электрофореза. Выход целевого продукта составляет 93% от расчетного значения.
Похожие статьи
-
Формула изобретения - Медицинские препараты на основе декстрана
1. Способ получения флуоресцентных производных декстранов, включающий проведение реакции флуоресцентного красителя с активированным производным декстрана...
-
Строение и классификация декстрана - Медицинские препараты на основе декстрана
Декстран - полимер глюкозы, продуцируемый бактериями Leuconostoc Mesenteroides при выращивании их на среде, содержащей сахарозу. Особые указания:...
-
Технология получения декстранов - Медицинские препараты на основе декстрана
Продуцентами декстранов являются штаммы Leuconostac mesente-roides, растущие на средах с высоким содержанием сахарозы (10-30 %), дестраном-"затравкой",...
-
Введение - Медицинские препараты на основе декстрана
Декстран - (dextran) - углевод, содержащий разветвленные цепи остатков глюкозы, которые являются продуктами жизнедеятельности бактерий и грибков....
-
Инфузионные среды, Коллоидные инфузионные растворы - Медицинские препараты на основе декстрана
Инфузионные среды - препараты, применяемые для парентеральной жидкостной терапии. Все инфузионные среды, или растворы, в зависимости от свойств и...
-
Заключение - Медицинские препараты на основе декстрана
Декстраны (С6Н10О5)n, группа бактериальных полисахаридов, состоящих из остатков D-глюкопиранозы. Молекулы декстранов - разветвленные цепи (см. ф-лу),...
-
Литература - Медицинские препараты на основе декстрана
1. Shimizu N, Kawazoe Y. - A new method for permeabilization of the plasma membrane of cultured mammalian cells. III. Intemalization of fluorescent...
-
Эволюция на основе ядерных реакций - Эволюция и строение звезд
При температуре в ядрах ~ 106 К начинаются первые ядерные реакции - выгорают дейтерий, литий, бор. Первичное количество этих элементов настолько мало,...
-
ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ - Фотонный двигатель
Изобретение предназначено для использования в авиации и космонавтике Известен фотонный двигатель , состоящий из основного корпуса и мощного импульсного...
-
Здесь рассматривается межорбитальная транспортная система по своему построению аналогичная той, что исследована в работах [1, 2], однако дополнительно...
-
Необходимость разработки принципиально новых средств межорбитальной транспортировки (СМТ) связана со следующими причинами: размещением значительной части...
-
Математическое описание - Черные дыры
Для любого астрономического объекта (планеты или звезды) можно вычислить так называемую скорость убегания, или вторую космическую скорость, позволяющую...
-
Основной продукт питания японии Рис Для японцев (на японском языке звучит как "гохан" - "главная еда") - основной, священный продукт, отношение к...
-
Описание топологий сетей и ее архитектура организации Выбор используемой топологии зависит от условий, задач и возможностей, или же определяется...
-
Конечные стадии эволюции звезд
Конечные стадии эволюции звезд Сверхновые звезды - это массивные звезды, светимость которых внезапно увеличивается до огромной величины, а затем...
-
Как и все тела в природе, звезды не остаются неизменными, они рождаются, эволюционируют, и наконец "умирают". Чтобы проследить жизненный путь звезд и...
-
Основы планетарного карантина - Поиск и исследование внеземных форм жизни
Еще с древних времен человечество привлекала перспектива открытия и изучения внеземных форм жизни. Теперь, когда исследование космического пространства...
-
Описание стратегии удержания КА - Космический аппарат
Как было сказано в предыдущем разделе, для длительного удержания КА на гало-орбите требуется, чтобы коэффициент перед возрастающей компонентой равнялся...
-
Исследования последних лет показали возможность синтеза разнообразных биологически важных веществ из простых исходных соединений типа аммиака, метана,...
-
Разновидности права собственности - Основы гражданского права
1. Частная собственность гражданина: земельные участки, дома, квартиры, дачи, предприятия, здания, сооружения, транспортные средства, ценные бумаги. 2....
-
Математическое описание модели Модель "Radiocity" Расчет излучения в результате переотражения элементами космического аппарата друг на друга выполнятся с...
-
Как было сказано в предыдущем разделе, для длительного удержания КА на гало-орбите требуется, чтобы коэффициент перед возрастающей компонентой равнялся...
-
Развитие планетной космогонии - Происхождение Солнечной системы
Солнце спутник земля планетный В 1775 г. нем. ученый И. Кант пытался объяснить единообразный характер движения планет формированием их из рассеянного...
-
СВЕРХНОВЫЕ. - Жизненный путь звезд
Около семи тысяч лет назад в отдаленном уголке космического пространства внезапно взорвалась звезда, сбросив с себя наружные слои вещества. Сравнительно...
-
Звезды среднего размера - Эволюция звезд
При достижении звездой средней величины (от 0,4 до 3,4 солнечных масс) фазы красного гиганта в ее ядре заканчивается водород и начинаются реакции синтеза...
-
Режим труда и отдыха предусматривает соблюдение определенной длительности непрерывной работы на ПК и перерывов, регламентированных с учетом...
-
Около семи тысяч лет назад в отдаленном уголке космического пространства внезапно взорвалась звезда, сбросив с себя наружные слои вещества. Сравнительно...
-
Ответ: "Красными книгами" называются справочники, содержащие сведения о распространении, численности, биологии и мерах охраны редких видов животных и...
-
Краткие исходные данные. - Тайна прецессии Земной оси
Достаточно подробное и последовательное обоснование, приведено в [2], однако это обоснование носит очень разноплановый характер. Для сокращения и...
-
Источники энергии звезд - Энергия звезд
Наиболее очевидным свойством звезд является то, что они светятся, точнее, являются самосветящимися телами. За счет чего покрываются их энергетические...
-
Скорости звезд, Измерение скорости - Измерение количественных и качественных характеристик звезд
Измерение скорости Для большинства звезд никакого перемещения заметить не удается, потому что они слишком далеки от нас, а наблюдения, хоть и проводились...
-
"Разновидности масс тел", Молодые звезды малой массы - Особенность эволюции звезд
Молодые звезды малой массы Это еще по сути протозвезды, в центре которых только начинаются ядерные реакции, и все излучение происходит, в основном, из-за...
-
Эволюция звезд и геометрическая турбулентность - Геометрическая турбулентность и эволюция звезд
Используем полученные результаты для доказательства того, что горение вещества в звездах обусловлено только изменением метрики пространства-времени....
-
В заключение главы приведем один из наиболее ярких примеров поиска внеземных форм жизни. В 1976 г. НАСА в США проведен запуск двух автоматических...
-
Рождение и эволюция отдельных типов звезд - Общие сведения о звездах и их типологии
Процесс звездообразования. Эволюция звезд -- это изменение со временем физических характеристик, внутреннего строения и химического состава звезд....
-
Черные дыры - Особенности теории конца жизни звезд
Термин "черная дыра" был весьма удачно введен в науку Джоном Уиллером в 1968 для обозначения "застывшей", сколлапсировавшей звезды. Рассмотрим, что...
-
Нейтронные звезды - Особенности теории конца жизни звезд
Существование нейтронных звезд - звезд, состоящих из вырожденных нейтронов - предсказывалось теоретиками еще в 30-х годах (первым это понял...
-
Особенности теории конца жизни звезд, Общие - Особенности теории конца жизни звезд
Общие По современным представлениям, первичное вещество во Вселенной, образовавшееся в "первые три минуты" после Большого Взрыва, примерно на три...
-
Сверхновые. - Эволюция и типы звезд
Около семи тысяч лет назад в отдаленном уголке космического пространства внезапно взорвалась звезда, сбросив с себя наружные слои вещества. Сравнительно...
-
Баллистическое проектирование В баллистическом проектировании выбирается и уточняется схема перелета РБ. Наилучшая схема перелета соответствует...
Описание изобретения к патенту - Медицинские препараты на основе декстрана