Використання рекомбінантних штамів роду Penicillium в харчовій та текстильній промисловості - Створення рекомбінантних штамів грибів роду Penicilliumі

Ферментні препарати, які отримують на основі грибних штамів-продуцентів, широко застосовуються в процесах отримання вина, плодово-ягідних соків, джемів, пюре та інших продуктів з плодово-ягідної сировини.

Ферментативний гідроліз плодово-ягідної сировини забезпечується карбогідразним комплексом - сукупністю ферментів різної специфічності, які розщеплюють молекули полісахаридів з утворенням оліго - та моносахаридів. Якісний склад ферментних препаратів залежить від складу плодово-ягідної сировини. Оскільки основними компонентами клітинних стінок рослин є целюлоза та пектини, то відповідно ферментні препарати для її гідролізу повинні мати, перш за все, целюлолітичну та пектолітичну активності [2].

Власне кажучи, розглянуті у попередньому розділі рекомбінантніштамиPenicilliumverruculosum ВКМ F-4587D іPenicilliumverruculosum ВКМ F-4586D, і були створені для отримання ферментів гідролізу плодово-ягідної сировини. Оскільки реципієнтний штам P. verruculosum BI-537 niaD(-) мав низьку пектинолітичну активність, то було запропоновано вбудувати у його геном ген пектинліази А з P. Canescens. Пектинліаза - фермент, що каталізує реакцію розщеплення б-1,4-D-глікозидного зв'язку між метоксильованими залишками галактуронової кислоти у складі пектинових речовин. Особливої властивістю цього ферменту є те, що він діє на етерифікованийгомогалактуронан без попередньої деетерифікації, яка зазвичай передує гідролітичному розщепленню пектину. Тому завдяки пектинліазівідбувається освітлення соків без руйнування летких ефірних компонентів, які обумовлюють специфічний фруктовий запах.

Дослідниками було вирішено вбудовувати ген пектинліази А з P. Canescens, оскільки, на відміну від пектинліаз з A. Niger, оптимум рН для яких складає від 6,0 до 8,5 одиниць, обрана пектинліаза "працює" в умовах рН=5,0 і є стабільною при рН від 4,0 до 3,3 - нативномурН фруктів та ягід. Пектинліаза А з P. Canescens після 3 годин інкубування при рН=4,0 і кімнатній температурі зберігає більше 90% активності, а при зростанні температури до 40°С і 50°С активність пектинліази залишається на рівні 70% і 40% від вихідної активності.

Окрім гену пектинліази А в геном P. Verruculosum BI-537 niaD(-) був вбудований ген в-глюкозидази з A. Niger. Ферментні препарати з в-глюкозидазою покращують органолептичні показники продуктів, виготовлених з плодово-ягідної сировини. Наприклад, в-глюкозидазу використовують для зменшення гіркоти цитрусових соків та джемів [2].

Отже, за допомогою методів генетичної інженерії дослідникам вдалося створити рекомбінантні штами P. Verruculosum і отримати ферментний препарат, який можна застосовувати в технологічних процесах харчової промисловості, пов'язаних з переробкою плодово-ягідної сировини.

Метою іншої дослідницької групи було отримання рекомбінантного штаму Penicilliumgriseoroseum, який одночасно продукує значну кількість пектинліази (PL) та полігалактуронази (PG) [6]. Ці ферменти розщеплюють б-1,4-глікозидні залишки відповіднопектинової та полігалактуронової кислот. Для досягнення поставленої мети штам з високою продукцією PL був трансформований плазмідоюpAN52pgg2, яка несла ген, що кодує PGР. Griseoroseum, під контролем промотора гена Gpd з Aspergillusnidulans. В результаті рекомбінантний штам P. griseoroseumТ20 продукував рівні PL та PG, які були відповідно у 266- і 27 разів вищими, ніж у штаму дикого типу.

У Р. Griseoroseum є два гена, які кодують PL(Plg1 и Plg2) і два гена, що кодують PG(Pgg2 и Pgg1). Гени Plg1 и Pgg2 представлені однією копією в геномі Р. Griseoroseum і вносять найбільший вклад в продукцію PL і PG, крім того, вони регулюються на рівні транскрипції та індукуються пектином і репресуються глюкозою. Зважаючи на цей факт, дослідники намагалися отримати рекомбінантний штам Р. Griseoroseum без необхідності індукції його ферментативної активності пектином. Виявилося, що заміна ендогенного промотора генів, які кодують пектиназиу Р. Griseoroseum, сильним і конститутивним промотором, таким як промотор гена GpdЗ A. Nidulans, призвела до збільшення продукування PG і PL при використанні альтернативних джерел вуглецютаких як сахароза і сік цукрової тростини. Пов'язано це з тим, що заміна регуляторної області усуває необхідність в індукції та катаболітній репресії, котру розглядали як перешкоду для продукування пектиназ при використанні альтернативних джерел вуглецю. Зважаючи на широке розповсюдження вирощування цукрової тростини і технологію її обробки, використання цього джерела вуглецю в якості субстрата для виробництва грибних ферментів демонструє значний потенціал та низьку вартість.

Важливою особливістю отриманого штаму P. griseoroseumТ20 є те, що в умовах синтезу PLі PG він не продукує целюлаз і протеаз. В текстильній промисловості наявність целюлази може послабити міцність волокон, а наявність протеаз може зменшити стабільність PLі PG.

Отже, рекомбінантний штам P. griseoroseumТ20 можна використовувати як джерело ферментного препарату, який можна застосовувати як в текстильній промисловості, так і в харчовій. До того ж, ферменти Т20, які кодуються генами Plg1 и Pgg2, працюють в широкому діапазоні рН, мають високу термічну стабільність і можуть зберігатися принаймні протягом двох місяців без втрати активності. Ці особливості вказують на те, що ферменти PLі PG, які продукуються Т20, є перспективними для застосування у промислових процесах освітлення фруктових соків з кислим рН, таких як томатний, апельсиновий та яблучний [6].

Пізніше цією ж дослідницькою групою був створений рекомбінантний штам Р. griseoroseum T146, який продукував значно більше PG у порівнянні з контрольним штамом PG63. Для збільшення синтезу PGкодуючу область гена Pgg2Клонували під контролем промотора гена гліцеральдегід-3-фосфатдегідрогенази (Gpd) і термінаторної області гена триптофан синтази(TrpC) з Aspergillusnidulans (pAN52pgg2 вектор). Потім цей вектор використовували для трансформації P. griseoroseum. Як наслідок, штам Т146 мав додаткову копію гена Pgg2, що призвело до 12-кратного збільшення рівня синтезу PG. Як і P. griseoroseumТ20, Р. griseoroseum T146 здатний був використовувати сахарозу і сік цукрової тростини в якості альтернативного джерела вуглецю[7].

Нові ферментативні препарати (ФП) з високою пектиназною та геміцелюлазноюактивностями були отримані і на основі створення рекомбінантних штамів Penicilliumcanescens. Ці штами синтезували гомологічну пектинліазу А та гетерологічніендо-1,5-б-арабіназу А і ендо-1,4-альфа-полігалактуроназу, а також ферменти штама-господаря(б-L-арабінофуранозидази, ксиланази та інші). Ферментні препарати, отримані з культурального середовища рекомбінантних штамів P. саnescens, ефективно гідролізували рослинну сировину з високим вмістом пектинових сполук. Так, було показано, що вихід відновлюючих вуглеводів та арабінози збільшився на 16 і 22% порівняно з контрольним ферментним препаратом на основі штаму-господаря, коли один з отриманих ФП використовували для гідролізу жому, отриманого з цукрового буряку. Найбільш активний ферментний препарат мав у своєму складі пектинліазу (10%), ендо-1,5-арабіназу (26%), б-L-арабінофуранозидазу та арабіноксилан-арабінофураногідролазу (12%), а також ксиланазу (10%) [5].

Похожие статьи




Використання рекомбінантних штамів роду Penicillium в харчовій та текстильній промисловості - Створення рекомбінантних штамів грибів роду Penicilliumі

Предыдущая | Следующая