Моделирование нормобарической гипоксии in vitro - Антигипоксическое и нейропротекторное действие N-арахидоноилдофамина при моделировании острой гипоксии in vivo и in vintro

Гипоксию In vitro Моделировали на 21-й DIV путем замены на 10 минут нормоксической культуральной среды на среду без кислорода. Для вытеснения кислорода из среды ее насыщали инертным газом аргоном, способным вытеснять кислород из жидкостей за счет большей растворимости по сравнению с кислородом. Химическая инертность аргона обеспечивает адекватные условия для проведения эксперимента. Аргон подавали из баллона по газоотводной трубке с иглой на конце, под давлением 1-1,5 МПа, течение 10 мин в среду, помещенную в герметичный сосуд. Для того, чтобы в сосуде не накапливалось избыточное давление, выше уровня жидкости находился конец второй иглы, соединенной с выводящей газоотводной трубкой.

Концентрация растворенного кислорода в среде определяли методом йодометрического титрования (метод Винклера) (Лурье, 1973). Данный метод основан на способности гидроксида марганца (II) окисляться в щелочной среде до гидроксида марганца (IV), количественно связывая при этом кислород. В кислой среде гидроксид марганца (IV) снова переходит в двухвалентное состояние, окисляя при этом эквивалентное связанному кислороду количество йода. Выделившийся йод оттитровывают раствором тиосульфата натрия в присутствии крахмала в качестве индикатора. При насыщении среды инертным газом содержание кислорода снижалось с 3,26 мл/л (нормоксия) до 0,37 мл/л (гипоксия). Для предотвращения насыщения среды кислородом воздуха, культуры помещали в гипоксическую камеру, представляющей собой пластиковую чашку Петри (Corning) диаметром 100мм с двумя вмонтированными пластиковыми штуцерами для подключения газовых шлангов. Для герметизации нижняя часть чашки Петри проклеена уплотнительной резиной. К первому штуцеру присоединен шланг, который через редуктор соединен с газовым баллоном. Ко второму штуцеру присоединен газоотводный шланг. После замены нормоксической среды на гипоксическую культуру помещали в камеру, после чего в течение 1 мин через камеру пропускали аргон при открытом газоотводном шланге. Затем перекрывали сначала газоотводный шланг, а потом шланг, по которому поступал аргон. В таком положении камера с помещенной в нее клеточной культурой оставалась еще на 9 минут. Суммарное время гипоксичекого заменяли гипоксическую среду на нормоксическую (Ведунова с соавт., 2012, 2013).

Исследуемые вещества добавляли в гипоксическую среду при гипоксии и в течение первых суток после нее. Параметры спонтанной биоэлектрической активности, характеризующие реакцию нейронов на гипоксию, регистрировали сразу после реоксигенации, через 2 часа и каждые 24 часа в течение 7 дней после гипоксии.

Похожие статьи




Моделирование нормобарической гипоксии in vitro - Антигипоксическое и нейропротекторное действие N-арахидоноилдофамина при моделировании острой гипоксии in vivo и in vintro

Предыдущая | Следующая