Клонирование овец - Клонирование

Уиландсин еще в 1986 году показал, что эмбрионы овец на 16-клетоной стадии развития сохраняют свою тотипотентность. Реконструированные яйцеклетки, содержащие ядра бластомеров 16-клетоных зародышей, развивались нормально до стадии бластулы в перевязанном яйцеводе овцы (в агаровом цилиндре), а после освобождения от агара, пересаживали в матку овцы - второго реципиента - еще на 60 дней. В другом случае донорами служили ядра 8-клетоных зародышей и были получены три живых ягненка, фенотип которых соответствовал породе овцы-донора.

В 1989 году Смит и Уилмут трансплантировали ядра клеток 16-клетосного эмбриона и ранней бластулы в лишенные ядра неоплодотворенной яйцеклетки овец. В первом случае было получено два живых ягненка, фенотип которых соответствовал породе овец - доноров ядер. Во втором - один полностью сформировавшийся ягненок погиб во время родов. Его фенотип также соответствовал породе-донору. Авторы считали, что в ходе дифференциации эмбрионных клеток происходит инактивация некоторых важных для развития генов и в результате ядра бластулы уже не могут репрограммироваться в цитоплазме яйцеклетки и обеспечить нормальное развитие реконструированного зародыша. Поэтому в качестве доноров ядер лучше использовать 16-клеточные эмбрионы или культивированные in vitro линии эмбриональных клеток, ядра которых обладают тотипотентностью.

Позднее, в 1993-95 гг., группа исследователей под руководством Уилмута получила клон овец - пять идентичных животных, донорами ядер которых была культура эмбриональных клеток. Клеточную культуру получали следующим образом: выделяли микрохирургическим путем эмбриональный диск из 9-дневного овечьего эмбриона (бластулы) и культивировали клетки in vitro в течение многих пассажей (по крайней мере, до 25). Сначала клеточная культура напоминала культуру стволовых дифференцированных эмбриональных клеток, но вскоре, после 2-3 пассажей, клетки становились уплотненными и морфологически сходными с эпителиальными. Эта линия клеток из 9-дневного зародыша овцы была обозначена как TNT4.

Чтобы донорское ядро и реципиентная цитоплазма находилась на сходных стадиях клеточного цикла, останавливали деление культивируемых клеток TNT4 на определенной стадии (GO) и ядра этих клеток пересаживали в энуклеированные яйцеклетки (соответственно на стадии метафазы II). Реконструированные эмбрионы заключали в агар и трансплантировали в перевязанные яйцеводы овец. Через шесть дней эмбрионы вымывали из яйцеводов промежуточных реципиентов и исследовали под микроскопом. Отбирали те, которые достигали стадии морулы и бластулы и пересаживали их в матку овцы - окончательного реципиента, где развитие продолжалось до рождения. Родилось пять ягнят (самок), из них две погибли вскоре после рождения, третья в возрасте десяти дней, а две оставшихся нормально развивались и достигли 8-9-месячного возраста. Фенотипически все ягнята были сходны с породой овец, от которой получали исходную линию клеток TNT4. Это подтвердил и генетический анализ.

Эта работа, особенно в части культуры эмбриональных клеток, - значительное достижение в клонировании млекопитающих, хотя она и не вызвала особого интереса, как статья того же Уилмута с соавторами, опубликованная в 1997 году, где сообщалось, что в результате использования донорского ядра клетки молочной железы овцы было получено клональное животное - овца по кличке Долли. Последняя работа методически во многом повторяла предыдущие исследования 1996 года, но в ней ученые использовали не только эмбриональные, но еще и фибробластоподобные клетки (фибропласты - клетки соединительной ткани) плода и клетки молочной железы взрослой овцы. Клетки молочной железы получали от 6-летней овцы породы Финн Дорсет, находящейся на последнем триместре беременности. Все три типа клеточных культур имели одинаковое число хромосом - 54, как обычно у овец. Эмбриональные клетки использовали в качестве доноров ядер на 7-9 пассажах культивирования, фибробластоподобные клетки плода на 4-6 пассажах и клетки молочной железы на 3-6 пассажах. Деление клеток всех трех типов оставливали на стадии GO и ядра клеток пересаживали в энуклеированные ооциты (яйцеклетки) на стадии метафазы II. Большинство реконструированных эмбрионов сначала культивировали в перевязанном яйцеводе овцы, но некоторые эмбрионы культивировали in vitro в определенной среде. Коэффициент выхода морул и бластул при культивировании in vitro в одной серии опытов был даже вдвое выше, чем при культивировании в яйцеводе (поэтому, видимо, нет строгой необходимости в промежуточном реципиенте и можно обойтись культивированием in vitro).

Выход морул и бластул в серии опытов с культурой клеток молочной железы, был примерно втрое меньше, чем в двух других сериях, когда в качестве доноров ядер использовали фибропластов плода или эмбриональных клеток. Число живых ягнят в сравнении с числом пересаженных в матку окончательного реципиента морул или бластул было также в два раза ниже. В серии опытов с клетками молочной железы и 277 реконструированных яйцеклеток был получен только один живой ягненок, что говорит об очень низкой результативности такого рода экспериментов (0,36%). Анализ генетических маркеров всех семи родившихся в трех сериях экспериментов живых ягнят показал, что клетки молочной железы были донорами ядер для одного, фибропласты плода - для двух и эмбриональные клетки четырех ягнят. Овца Долли развилась из реконструированной яйцеклетки, донором ядра которой была культивируемая клетка молочной железы овцы породы Финн Дорсет. Долли фенотипически не отличается от овец этой породы, но сильно отличается от овцы-реципиента породы шотландская черномордая. Анализ генетических маркеров подтвердил тот результат.

Успех авторов этой работы, прежде всего, связан с использованием длительных клеточных культур, так как после многих пассажей в культуре клеток могли быть отобраны малодифференцированные стволовые клетки, которые вероятно и были использованы как доноры ядер. Большое значение имел также тот факт, что авторы, учитывая результат своих прошлых работ, синхронизировали стадии клеточного цикла яйцеклеток реципиента и яйцеклеток донора.

Своей работой Уилмут с коллегами продемонстрировали, что ядра клеток молочной железы взрослой овцы могут быть при определенных условиях репрограммированы цитоплазмой ооцита и дать развитие новому организму. Полученные данные заставили по-новому посмотреть на процесс клеточной дифференцировки. Этот процесс, как оказалось, не носит необратимый характер. Совершенно ясно, что цитоплазматические факторы способны инициировать развитие нового организма на основе генетического материала ядра взрослой полностью дифференцированной клетки. Таким образом, биологические часы могут быть повернуты вспять, и развитие организма может начаться из генетического материала взрослой дифференцированной клетки, что полностью противоречит раннее общепринятой биологической догме.

Похожие статьи




Клонирование овец - Клонирование

Предыдущая | Следующая