Функциональный кальциевый имиджинг - Антигипоксическое и нейропротекторное действие N-арахидоноилдофамина при моделировании острой гипоксии in vivo и in vintro

Для имиджинговых исследований функциональной активности по параметру изменений [Ca2+]i, отражающих функциональное состояние кальциевого гомеостаза клеток, использовался лазерный сканирующий микроскоп LSM 510 (Zeiss, Германия). Методика позволяла визуализировать функциональную архитектуру нейрональной сети культуры на клеточном уровне. В качестве флуоресцентных зондов были выбраны специфический кальциевый краситель Oregon Green 488 BAPTA-1 АМ (OGB1) (Invitrogen) с константой диссоциации Кd=170 нМ, возбуждаемый линией излучения аргонового лазера 488 нм, и Са2+-нечувствительный краситель Sulforhodamine 101 (SR101) (Sigma), возбуждаемый излучением гелий - неонового лазера 543 нм, селективно маркирующий глиальные клетки (Nimmerjahn et al., 2004; Paredes et al., 2008). Эти длины волн близки к максимумам спектров поглощения соответствующих красителей. Излучение флуоресценции разделялось по каналам регистрации с помощью дихроичных зеркал и светофильтров с полосой пропускания 650-710 нм для выделения флуоресценции SR101 и 500-530 нм для выделения флуоресценции OGB1 (Митрошина с соавт., 2011).

Регистрировались временные серии изображений поля флуоресценции красителей Sulfophodamine 101 (SR101) как глиального маркера, и OGB1 как индикатора свободного кальция. Первичная обработка полученных изображений заключалась в разделении спектров этих красителей в разные каналы регистрации для идентификации нейрональных и глиальных клеток и записи функции F(t) Средней интенсивности флуоресценции OGB1 выделенной области поля (совпадающей, как правило, с телом или частью отростка клетки) от времени. Интенсивность флуоресценции (усл. ед.) показывала зависимость [Ca2+]i от времени, свидетельствующую о метаболической активности клеток, связанных в сети определенной архитектуры. Выделение кальциевых осцилляций, полученных при помощи флуоресцентной конфокальной микроскопии, проводили с использованием оригинального программного пакета "Astroscanner". Анализировались записи функции F(t) Средней интенсивности флуоресценции OGB1 выделенной области поля (совпадающей, как правило, с телом или частью отростка клетки) от времени. Для определения времени начала (Tstart) и конца (Tend) осцилляции был взят порог отклонения от среднего значения в размере стандартной квадратичной ошибки F(t). Отмечалось также время достижения максимальной интенсивности флуоресценции (Tmax) для каждой осцилляции. Учитывались следующие параметры: длительность достижения максимума (длительность "фронта" осцилляции), общая длительности осцилляции и интервалы между максимумами (Митрошина с соавт., 2011; Захаров с соавт., 2012; Zakharov et al., 2013).

Исследование влияния N-ADA на спонтанную кальциевую активность проводилось на 21-й DIV после 10-минутного гипоксического воздействия. Опытным группам при замене среды на гипоксическую, при реоксигенации и на следующие сутки проводилась аппликация N-ADA в разных концентрациях, а также аппликация N-ADA в сочетании с антагонистами CBR. К контрольной группе культур исследуемые вещества не добавлялись. В интактной группе осуществлялась полная смена нормоксической среды. Функциональный кальциевый имиджинг проводился во время моделирования гипоксии и на 7 сутки постгипоксического периода (табл. 1).

Похожие статьи




Функциональный кальциевый имиджинг - Антигипоксическое и нейропротекторное действие N-арахидоноилдофамина при моделировании острой гипоксии in vivo и in vintro

Предыдущая | Следующая