Электронно-лучевое повреждение в микроскопии: Pro et contra

Интересно отметить то, что, помимо вышеописанного негативного влияния на электронно-микроскопические изображения, в некоторых случаях лучевые повреждения могут предоставить необходимую структурную информацию. Так, было замечено, что белок, окруженный ДНК, начинает "вскипать" быстрее, чем тот, который расположен в контакте со льдом [16-18]. При этом сама ДНК не кипит и не образует пузырей при получении тех же самых доз электронов. Такое раннее "кипение" может быть связано с тем, что ДНК нарушает диффузию продуктов радиолиза от места их образования, что приводит к их быстрому накоплению и раннему образованию пузырей [17]. В ситуациях, когда белок неразличим на фоне окружающей его ДНК, образование пузырей, имеющих гораздо меньшую плотность и хорошо видимых на изображениях, позволяет судить о наличии и размерах расположенных внутри белковых частиц.

Такие картины наблюдались при изучении строения бактериофагов [16-18]. Гигантские phiKZ-подобные бактериофаги имеют в капсиде белковое "внутреннее тело", вокруг которого плотно упакована ДНК вируса [19]. Ученые заметили, что если сделать пару снимков одной и той же вирусной частицы: с низкой (~10-20 e?/Е2) и с высокой (~40-60 e?/Е2) дозой электронов, то на втором изображении частица начинает "вскипать" в месте, где располагается внутреннее тело (рис. 6Б). При этом на первом изображении (рис. 6А) частицы выглядят неповрежденными, и внутреннее тело незаметно на фоне окружающей его ДНК. Линейные размеры объема, в котором происходит вскипание, позволяют реконструировать приблизительные размеры и расположение внутреннего тела [18]. После этого можно рассчитать трехмерную реконструкцию неповрежденных фагов, используя распределение пузырей на изображениях с высокой дозой для точного определения расположения внутреннего тела [16].

визуализация внутреннего тела в капсиде бактериофага el с помощью облучения высокой дозой электронов

Рисунок 6. Визуализация внутреннего тела в капсиде бактериофага EL с помощью облучения высокой дозой электронов. (А) изображение смеси фагов EL (большие частицы) и фагов SN (малые частицы), снятое в режиме низкой дозы электронов (10-20 e?/Е2). (Б) То же поле зрения после дополнительной экспозиции (доза ~40-60 e?/Е2). Белые стрелки указывают на закипание в области внутреннего тела в фагах EL. Фаги SN, не имеющие внутреннего тела, начинают гореть в вершинах капсида (черные стрелки). L -- липосомы. Масштабный отрезок -- 250 нм. Рисунок из [18].

Еще один бактериофаг, внутреннюю структуру которого изучали с помощью высоких доз -- T7 [17]. Авторы подробно изучили процесс зарождения пузырьков при облучении фаговых частиц и показали, что "кипение" начинается только после накопления критической концентрации продуктов радиолиза. Мощность дозы электронов влияет на возникновение пузырьков, и ее необходимо оценивать заранее для минимизации повреждения.

Другим параметром, который необходимо учитывать, является температура. Диффузия продуктов радиолиза от места их образования идет медленнее при более низких температурах (жидкий гелий имеет температуру около ?270 °C). Это может привести к накоплению продуктов радиолиза и более раннему электронно-лучевому повреждению, по сравнению с замораживанием при температуре жидкого азота (?196 °С). Подобные повреждения наблюдались ранее при томографических экспериментах [11].

Похожие статьи




Электронно-лучевое повреждение в микроскопии: Pro et contra

Предыдущая | Следующая