Характеристика Na+-Ca2+-обміну через плазматичну мембрану секреторних клітин слинних залоз комара-дергуна - Системи трансмембранного транспортування кальцію у секреторних клітинах слинних залоз личинки Chironomus Plumosus Linnaeus

Специфічність обмінника до одноваленитних катіонів. Внаслідок еквімолярної заміни Na+ катіонами Cs+, NH4+ або K+ відбувається збільшення амплітуди вхідного струму відносно струму Na+-Ca2+-обміну на 69,94 ± 4,03 (P = 0,0003, n = 10), 60,83 ± 15,11 (P = 0,042, n = 7) і 50,60 ± 8,75 (P = 0,031, n = 6)% відповідно. А внаслідок заміни Na+ у позаклітинному середовищі на OHNH3+, Li+ та NH2NH3+ амплітуда вхідного струму зменшувалася на 33,02 ± 5,52 (P = 0,003, n = 6), 41,52 ± 4,50 (P = 0,0009, n = 9) і 64,52 ± 1,71 (P = 0,0002, n = 6)% відповідно. Таким чином, одновалентні катіони за здатністю замінювати Na+ у Me+-залежному виведенні Ca2+ з цитозолю секреторних клітин слинних залоз комара-дергуна утворюють такий ряд:

Cs+ ? NH4+ ? K+ > Na+ > OHNH3+ ? Li+ > NH2NH3+,

Де співвідношення між амплітудами вхідних струмів, що супроводжують функціонування Cs+-Ca2+ - та Li+-Ca2+-обмінів, становить 2,91.

Отриманий нами ряд дозволяє зробити кілька висновків. По-перше, Na+-Ca2+-обмінник плазматичної мембрани досліджуваних клітин не належить до родини NCKX. Це випливає з того, що вхідний струм Me+-Ca2+-обміну (відображає фізіологічний режим функціонування обмінника) реєструється без наявності катіонів K+ у внутрішньоклітинному середовищі. Крім того, додавання катіонів К+ до позаклітинного середовища супроводжується збільшенням, а не зменшенням амплітуди вхідного струму. І, нарешті, ряд, що описує здатність одновалентних катіонів активувати K+-залежний Na+-Ca2+-обмін секреторних клітин (Lee et al., 2007), суттєво відрізняється від отриманого нами ряду. По-друге, за здатністю транспортувати катіони Li+ досліджуваний нами Na+-Ca2+-обмінник є близьким до описаної недавно родини NCLX (Palty et al., 2004).

Спорідненість обмінника до двовалентних катіонів. При еквімолярній заміні Са2+ у позаклітинному середовищі на Sr2+ і Ва2+ у відповідь на гіперполяризацію мембрани реєструється вхідний струм, за кінетикою досить близький до вхідного струму Na+-Ca2+-обміну. Тому ми припустили, що катіони Sr2+ і Ва2+ можуть транспортуватися Na+-Ca2+-обмінником і, відповідно, ці струми відображають Na+-Sr2+ - чи Na+-Ва2+-обмін через плазматичну мембрану.

За частоти гіперполяризувальних імпульсів 0,1 Гц амплітуда струму Na+-Sr2+-обміну виявилася більшою від амплітуди струму Na+-Са2+-обміну у 1,05 ± 0,01 раз (P < 0,01, n = 6). Амплітуда струму Na+-Ва2+-обміну теж була більшою від амплітуди струму Na+-Са2+-обміну у 1,22 ± 0,05 раз (P < 0,01, n = 6). Внаслідок збільшення частоти гіперполяризувальних імпульсів до 0,2 Гц як амплітуда струму Na+-Sr2+-, так і Na+-Ва2+-обміну суттєво зменшилися - на 62,05 ± 2,89 і 59,34 ± 2,65 відповідно. Причому, зменшення струму Na+-Ва2+-обміну виявилася статистично достовірно (P < 0,01, n = 6) суттєвішим, ніж аналогічне зменшення амплітуди струму Na+-Са2+-обміну, яке у цій серії дослідів становило 49,24 ± 1,77%.

У ході порівняння параметрів рівняння Хілла, розрахованих для залежності амплітуди вхідних струмів Na+-Me2+-обмінів від [Me2+]E (Рис. 9), напрошуються досить цікаві висновки. Перш за все, розраховане значення ІMax зростає в послідовності Ca2+ > Sr2+ > Ba2+. А значення коефіцієнта N І K0,5, навпаки, у названій послідовності суттєво зменшуються. Оскільки здатність до комплексоутворення у названій послідовності теж зменшується (Доссон и др., 1990), то зменшення коефіцієнта N, на нашу думку, зумовлене порушенням процесів каталітичної активації обмінника. Про здатність Ва2+ і Sr2+ замінювати Са2+ у каталітичній активації обмінника у літературі даних практично немає. Відомо лише, що катіони Ва2+ здатні каталітично активувати Na+-Ca2+-обмінник кардіоміоцитів (NCX1), але менш ефективно (KD ~10 мкмоль/л), ніж Са2+ (KD ~0,3 мкмоль/л; Trac et al., 1997). Про інші родини Na+-Сa2+-обмінників відомо лише те, що NCLX не каталізує, на відміну від NCX-білків, Na+-Ba2+-обмін навіть у зворотному режимі, чим він є подібніший до NCKX (Palty et al., 2004). Тому за здатністю транспортувати катіони Ba2+ і Sr2+ Na+-Сa2+-обмінник плазматичної мембрани секреторних клітин слинних залоз личинки комара-дергуна ближчий є до обмінників родини NCX.

Вплив катіонів перехідних металів. Внаслідок додавання Cd2+ у концентраціях 0,5-10 ммоль/л до позаклітинного розчину з фізіологічною [Ca2+] амплітуда струму Na+-Са2+-обміну збільшувалася. Але за 10 ммоль/л Cd2+ зростання струму було меншим, ніж за 5 ммоль/л. Таке зростання струму Na+-Са2+-обміну не зумовлене збільшенням [Ca2+]E внаслідок витіснення його катіонами Cd2+ з мембранозв'язаного стану чи значним транспортуванням Cd2+ обмінником. На користь цього свідчить той факт, що при збільшенні [Ca2+]E до 10 ммоль/л катіони Cd2+ теж збільшують амплітуду струму Na+-Са2+-обміну. А, слід зазначити, що за [Ca2+]E = 5 ммоль/л амплітуда вхідного струму Na+-Са2+-обміну вже практично не зростає. Це дає підставу стверджувати, що викликане Cd2+ збільшення струму Na+-Са2+-обміну зумовлене стимуляцією функціонування Na+-Ca2+-обмінника.

Внаслідок дії Ni2+ за фізіологічної [Ca2+]E амплітуда вхідного струму Na+-Ca2+-обмiну дозозалежно зменшувалася. Розрахована на основі середніх значень константа інгібування К0,5 для Ni2+ становила 7,93 ммоль/л, а коефіцієнт Хілла N виявився близьким до одиниці. Цікаво, що за підвищення позаклітинної [Ca2+] до 10 ммоль/л амплітуда струму Na+-Ca2+-обмiну внаслідок дії Ni2+ не зменшувалася, а зростала. Це свідчить, що катіони Ni2+ взаємодіють, по крайній мірі, з двома ділянками обмінника, викликаючи різні ефекти.

Катіони La3+, діючи на зовнішню поверхню плазматичної мембрани, спричиняють зменшення амплітуди струму Na+-Са2+-обміну як за фізіологічної, так і за підвищеної [Ca2+]E. В обох випадках залежність ефекту La3+ задовільно описується рівнянням Хілла (Рис. 10).

Збільшення константи інгібування К0,5 за підвищеної [Ca2+]Е дає змогу стверджувати, що La3+ у конкурентний спосіб зв'язується з Ca2+-зв'язуючою транспортувальною ділянкою і тим самим пригнічує функціонування Na+-Ca2+-обмінного механізму. Крім того, наші результати підтверджують дані інших авторів (Katzung, Reuter, Porzig, 1973; Shimizu, Borin, Blaustein, 1997) про відносно низьку афінність Na+-Ca2+-обмінника до La3+. Зокрема, здатність La3+ Інгібувати Na+-Ca2+-обмінник плазматичної мембрани збудливих клітин оцінюється K0,5, не меншим, ніж 0,5 ммоль/л (Blaustein, Lederer, 1999). Те, що за підвищеної [Ca2+]Е коефіцієнт N є дещо більший, ніж за фізіологічної [Ca2+]Е, і в обох випадках є меншим від одиниці, дозволяє говорити про наявність конкуренції La3+ з Са2+ за Са2+-зв'язуючу ділянку регуляторної петлі обмінника. Можливість стимуляції Na+-Cа2+-обмінника катіонами La3+ (паралельно із блокуванням та транспортуванням) доведена недавно у дослідженнях на клітинах яєчника китайського хом'ячка, в які експресували NCX1.1 (Reeves, Condrescu, 2003).

Таким чином, катіони перехідних металів по-різному впливають на Na+-Ca2+-обмін. Катіони Cd2+, які в еквімолярних концентраціях віддають перевагу з утворенню зв'язків з P - та S-вміснимими лігандами білків, стимулюють функціонування обмінника. Катіони La3+ досить ефективно взаємодіють з O - та N-вмісними лігандами, тому пригнічують Na+-Ca2+-обмін. Катіони Ni2+, які мають проміжні властивості, за низької [Ca2+]E пригнічують, а за високої - стимулюють.

Підтвердження наявності SH-груп у молекулі Na+-Ca2+-обмінника. Внаслідок додавання до внутрішньоклітинного розчину ДТТ (1 ммоль/л), а також GSH у концентрації 0,1, 0,5 і 1 ммоль/л амплітуда вхідного струму Na+-Ca2+-обміну зростала. Це збільшення зумовлене, очевидно, хелатуванням катіонів важких металів, які в невеликих кількостях зв'язані з СОО--групами транспортувального центру обмінника і характеризуються меншою спорідненістю до них, ніж до SH-груп досліджуваних сполук. У результаті збільшення концентрації GSH до 5 ммоль/л амплітуда струму Na+-Ca2+-обміну зменшилася відносно контролю на 5,92 0,96%. Причиною цього є, мабуть, хелатування катіонів важких металів, які зв'язані з SH-групами регуляторного центру обмінника.

Додавання ПХМБ до позаклітинного середовища не спричиняло достовірних змін амплітуди ні вхідного, ні вихідного струму Na+-Ca2+-обміну. Але внаслідок додавання ПХМБ до внутрішньоклітинного розчину у концентрації 1 і 5 мкмоль/л амплітуда вхідного струму Na+-Ca2+-обміну збільшується на 11,02 1,69 і 22,50 2,97% відповідно (Р < 0,01, n = 6). Амплітуда ж вихідного струму Na+-Ca2+-обміну збільшувалася лише за наявності у внутрішньоклітинному розчині 1 мкмоль/л ПХМБ на 7,94 2,47% (Р < 0,05, n = 6).

Отже, ми маємо всі підстави вважати, що блокування SH-груп молекули Na+-Ca2+-обмінника із цитоплазматичного боку мембрани за допомогою ПХМБ спричиняє зміни її конформації, а відтак і зміни у процесах взаємодії катіонів із центрами катіонного зв'язування або транслокації катіонів, які приводять до активації Na+-Ca2+-обміну.

Залежність Na+-Ca2+-обміну від pH середовища. Для встановлення особливостей функціонування Na+-Ca2+-обмінника досліджували залежність амплітуди його струму від рН позаклітинного і внутрішньоклітинного розчинів.

Зниження рН позаклітинного розчину від 7,2 до 4 викликало поступове зменшення амплітуди вхідного струму Na+-Ca2+-обміну (Рис. 11). Розрахунки показали, що залежність амплітуди від рН у цьому діапазоні задовільно описується рівнянням Хілла. Виходячи з величини рК, ми припускаємо, що в складі ділянок катіонного зв'язування обмінника функціонують СОО--групи аспарагінової або глютамінової амінокислот, оскільки їхнє рК становить відповідно 3,81 і 4,25 (Ленинджер, 1974). Але внаслідок закислення позаклітинного розчину амплітуда вхідного струму Na+-Ca2+-обміну змінюється повільніше, ніж того слід було очікувати за умови, що цей процес зумовлений протонуванням кислотних іоногенних груп однієї природи (коефіцієнт Хілла N < 1).

Внаслідок закислення зовнішнього розчину до рН 3 струм, який розвивається у відповідь на гіперполяризацію мембрани, у всіх випадках ставав вихідним. Цей струм може бути пов'язаний із зміною функціонування обмінника або ж мати іншу природу, встановлення якої потребує додаткових досліджень.

У ході дослідження залежності вхідного струму Na+-Ca2+-обміну від ступеня залужнення зовнішнього розчину з'ясувалось, що зміщення рН розчину від 7 до 8, 9 і 10 викликає суттєве збільшення амплітуди досліджуваного струму (Рис. 11). Причиною зростання амплітуди струму Na+-Ca2+-обміну внаслідок залужнення середовища може бути поява додаткових негативних зарядів у ділянці катіонного зв'язування, носіями яких, найімовірніше, є іонізовані тіосульфатні групи залишків цистеїнової амінокислоти.

Внаслідок залужнення внутрішньоклітинного розчину амплітуда вхідного струму Na+-Ca2+-обміну суттєво зменшувалася (Рис. 12). Значення рК вказує на те, що причиною цього зменшенням є, найімовірніше, депротонування SH-груп цистеїну великої цитоплазматичної петлі (рК' R-групи цистеїну становить 8,33 (Ленинджер, 1985)). Водночас, значення коефіцієнта N (< 1) дозволяє припустити, що одночасно депротонуються R-групи й інших амінокислот, з іншим значенням рК'.

Внаслідок зменшення концентраційного градієнта Na+ і його ліквідації зміни функціонування Na+-Са2+-обмінника мембрани секреторних клітин, спричинені залужненням внутрішньоклітинного розчину, є суттєвішими. Але ми не можемо категорично стверджувати, що залужнення дійсно призводить до порушення зв'язування Na+ з молекулою обмінника, оскільки і зменшення натрієвого градієнта, і залужнення спричиняють однакові зміни струму.

Ще суттєвіші зміни у функціонуванні Na+-Ca2+-обмінника внаслідок залужнення внутрішньоклітинного середовища спричинює збільшення концентраційного градієнта Ca2+. Якщо зменшення амплітуди вхідного струму Na+-Ca2+-обміну, що зумовлене залужненням внутрішньоклітинного розчину до pH 9, за [Ca2+]Е = 1,76 ммоль/л становило 55,57 10,13%, то за [Ca2+]Е = 10 ммоль/л - 72,38 10,22%.

Оскільки збільшення градієнта Са2+ за рН 9 супроводжується не збільшенням, а зменшенням амплітуди вхідного струму Na+-Ca2+-обміну, ми можемо однозначно стверджувати, що залужнення внутрішньоклітинного середовища призводить до пригнічення зв'язування Са2+ з внутрішньоклітинною петлею F Обмінника.

Таким чином, залужнення внутрішньоклітинного розчину, на відміну від залужнення позаклітинного, веде до зменшення амплітуди вхідного струму Na+-Ca2+-обміну, і, навіть, до зміни його напрямку і це є наслідком, мабуть, порушення каталітичної регуляції обмінника катіонами Са2+.

Слід зазначити, що каталітичне Са2+-регулювання забезпечує стимулювання функціонування Na+-Ca2+-обмінника в кардіоміоцитів ссавців (NCX1-типу) і, навпаки, пригнічення Na+-Ca2+-обмінника дрозофіли (Levitsky et al., 1996; Ruknudin et al., 1997). Тому за цією властивістю Na+-Ca2+-обмінник плазматичної мембрани секреторних клітин слинних залоз личинки Chironomus plumosus є ближчим до родини NCX.

Похожие статьи