Ідентифікація Са2+-транспортувальних систем секреторних клітин слинних залоз личинки Chironomus plumosus - Системи трансмембранного транспортування кальцію у секреторних клітинах слинних залоз личинки Chironomus Plumosus Linnaeus

Потенціалкеровані Са2+-канали плазматичної мембрани. Деполяризація плазматичної мембрани секреторних клітин слинних залоз гіперкалієвими розчинами супроводжувалася збільшенням вмісту Са2+ у їхній тканині (Рис. 1). Залежність К+-стимульованого збільшення вмісту Са2+ у тканині залози від [К+]Е задовільно описується рівнянням Хілла з близьким до одиниці коефіцієнтом N.

За зниженої до 35 ммоль/л [Na+]E залежність змін вмісту Са2+ від [К+]E виявилася менш вираженою і не описується рівнянням Хілла. Зумовлено це тим, що за фізіологічної [К+]E зниження [Na+]E супроводжується збільшенням вмісту Са2+ у тканині залоз у 2,01 ± 0,17 рази (P < 0,001, n = 6). За [К+]E 20 ммоль/л це збільшення становило лише 1,36 ± 0,17 рази (P < 0,05, n = 6), а за вищих концентрацій взагалі виявилося статистично недостовірним. Це дає змогу розглядати зменшення [Na+]E як своєрідне інгібування К+-стимульованого збільшення вмісту Са2+ у тканині залоз. Зумовлене це "інгібування", швидше за все, обмеженістю Са2+-ємності внутрішньоклітинних органел, тому однозначної відповіді, який вклад Na+-Ca2+-обміну через плазматичну мембрану у К+-стимульоване збільшення вмісту Са2+ ми не отримали.

Встановлено також, що вміст Са2+ у тканині зростає із збільшенням [Ca2+]E як у базальних умовах (5,36 ммоль/л К+), так і за гіперкалієвої деполяризації мембрани (40 ммоль/л К+). Згідно даних двофакторного дисперсійного аналізу вміст Са2+ у тканині залоз з високим ступенем ймовірності (Р < 0,001) визначається [Ca2+]E на 67,87% і лише на 9,14% [K+]E. Спільний вплив обох факторів є ще меншим і становить лише 5,17% (Р < 0,05). Властиво, це і має спостерігатися, оскільки малоймовірний є вхід Са2+ у цитоплазму із позаклітинного середовища, в якому він практично відсутній. За підвищеної до 5 ммоль/л [Ca2+]E статистично достовірні зміни вмісту Са2+ у тканині під впливом гіперкалієвої деполяризації теж є відсутні. Причиною цього є зростання вмісту Са2+ у тканині із збільшенням [Ca2+]E вже за фізіологічної [K+]E. І лише за фізіологічної [Ca2+]E гіперкалієва деполяризація спричиняє достовірне збільшення Са2+ у тканині.

К+-стимульоване збільшення вмісту Са2+ у тканині залоз пригнічується La3+ з константою інгібування К0,5 = 70 мкмоль/л. Значення коефіцієнта Хілла (N = 0,47) свідчить про можливу наявність негативної кооперативності і є наслідком, мабуть, того, що La3+ пригнічує не лише Са2+-транспортувальні системи, які забезпечують Вхідний потік Са2+, але і системи Вихідного Потоку. Оскільки К0,5 інгібування K+-стимульованих змін вмісту Са2+ у тканині суттєво менша, ніж К0,5 інгібування струму Na+-Ca2+-обміну (див. Рис. 10), то, найімовірніше, катіони La3+ пригнічують і потенціалкеровані Са2+-канали, і Са2+-помпу плазматичної мембрани.

Крім того, К+-стимульоване збільшення вмісту Са2+ у тканині залоз пригнічується верапамілом (на 58,82%; P < 0,01, n = 6), дилтіаземом (на 64,50%; P < 0,05, n = 6) та ніфедипіном (на 62,02%; P < 0,05, n = 6). Дилтіазем і ніфедипін пригнічували і стимульоване гіперкалієвим розчином збільшення вмісту мембранозв'язаного Са2+. Це підтверджує наявність у мембрані досліджуваних секреторних клітин раніше ідентифікованих (Клевец, Гураль, 1990; Клевець, Манько, 1992) потенціалкерованих Са2+-каналів. Потенціалкеровані Са2+-канала ідентифіковані також у плазматичній мембран секреторних клітин слинних залоз амазонської п'явки Haementeria ghilianii (Wuttke, Berry, 1993; Wuttke, Munsch, Deitmer, 1996).

Функціональне підтвердження наявності Na+-Ca2+-обміну через плазматичну мембрану. Залежність змін нормалізованого вмісту Са2+ у тканині від [Na+]E задовільно описується рівнянням Хілла з коефіцієнтом N = 6,60 (Рис. 2, крива 1). Але у цьому випадку розрахована крива віддаляється від експериментальних точок, отриманих за умови збереження фізіологічної осмотичності. Графік Хілла для тих експериментальних точок, які були визначені за фізіологічної осмотичності середовища (Рис. 2, крива 2), характеризується значно меншим коефіцієнтом N (2,32). Ми схиляємося до думки, що високе значення коефіцієнта N у рівнянні Хілла для усіх експериментальних точок зумовлена порушенням осмотичності середовища. Тим не менше, той факт, що значення коефіцієнта N > 2, дає змогу стверджувати про електрогенність Na+-Ca2+-обміну через мембрану досліджуваних клітин.

Залежність збільшення вмісту Ca2+ у тканині, стимульоване інкубацією залоз у гіпонатрієвому середовищі, від [Сa2+]Е теж задовільно описується рівнянням Хілла (Рис. 3). Високе значення коефіцієнта N цієї залежності аж ніяк не можна розцінювати як доведення здатності Na+-Ca2+-обмінника плазматичної мембрани транспортувати 2 катіони Са2+ у клітину взамін виведення кількох (скількох?) катіонів Na+. Швидше за все, зміни вмісту Са2+ у тканині залоз у цій серії дослідів спричинені не лише функціонуванням обмінника у зворотному режимі, а й зміною функціональної активності Са2+-помпи плазматичної мембрани. Збільшення позаклітинного Са2+ повинно зменшувати швидкість транспортування Са2+ помпою і навпаки. Це пов'язано не з афінністю Са2+-помпи плазматичної мембрани до цитозольного Са2+, яка є набагато вищою за афінність Na+-Ca2+-обмінника (Blaustein, Lederer, 1999), а лише з термодинамічним зміщенням.

Ідентифікація струму Na+-Ca2+-обміну. У відповідь на Гіперполяризувальне зміщення мембранного потенціалу прямокутними імпульсами від рівня фіксованого потенціалу за наявності фізіологічного натрієвого градієнта (ENa = +54,2 мВ) через мембрану секреторних клітин розвивається вхідний струм, що характеризується повільною кінетикою зростання (Рис. 4 А). Ліквідація натрієвого градієнта (ЕNa = 0 мВ) призводить до суттєвого зменшення амплітуди вхідного струму. За зворотного натрієвого градієнта (ЕNa = -40,3 чи -46,3 мВ) у відповідь на гіперполяризацію мембрани виникає струм вихідного напрямку (Рис. 4 Б).

Вихідний струм розвивається і у відповідь на Деполяризувальне зміщення мембранного потенціалу від рівня фіксованого потенціалу за фізіологічного натрієвого градієнта, наявності у середовищі верапамілу, еозину Y, відсутності у розчинах К+ та за хлорного градієнта, зміненого таким чином, щоб ЕCl дорівнював тестованому потенціалу. Амплітуда виявленого за таких умов вихідного струму, як і вхідного, що розвивається у відповідь на гіперполяризацію мембрани, залежить від натрієвого градієнта: як зменшення [Na+]Е, так і збільшення [Na+]І викликала її суттєве зменшення. Отримані результати узагальнені на Рис. 5 у вигляді залежності амплітуди струмів, що розвиваються у відповідь на гіпер - та деполяризацію плазматичної мембрани, від рушійної сили іонів Na+ (ДЕNa = EM - ENa) при тестованому потенціалі.

Крива залежності амплітуди вихідного струму, який розвивається у відповідь на гіперполяризацію плазматичної мембрани за фізіологічного натрієвого градієнта, від рушійної сили транспорту Na+ (криві 3 і 4 на Рис. 5) не перетинає вісь абсцис при ДЕNa = 0 мВ. Аналогічна закономірність характерна і для вихідних струмів, спричинених деполяризацією плазматичної мембрани (криві 6 і 8). Тобто, внаслідок зміни знаку ДЕNa при тестованому потенціалі не змінюється ні напрям струму, ні характер залежності амплітуди вихідного струму від ДЕNa. Це свідчить, що вихідні струми, спричинені як гіперполяризацією мембрани, так і деполяризацією, є не канальними та визначаються не тільки натрієвим електрохімічним градієнтом.

Знак ДЕNa при фіксованому потенціалі визначає напрям струму. За негативного значення ДЕNa у відповідь на гіперполяризацію мембрани виникає струм вхідного напрямку (криві 1, 2, 5 і 7), а за позитивного - вихідного напрямку (криві 3 і 4). Для струму, що виникає у відповідь на деполяризацію мембрани, притаманна зворотна закономірність: за негативного значення ДЕNa при тестованому потенціалі виникає струм вихідного напрямку (криві 6 і 8).

Є також усі підстави вважати, що струм, зареєстрований у відповідь на раптову зміну мембранного потенціалу, визначаються й електрохімічним градієнтом Ca2+. На Рис. 6 представлено залежність амплітуди вхідного струму Na+-Ca2+-обміну від [Сa2+]E. Вхідний струм Na+-Ca2+-обміну, зареєстрований за фізіологічного натрієвого градієнта, відображає Na+E-залежне виведення з клітини цитозольного Са2+. У зв'язку з цим його амплітуда мала би прямо залежати від [Сa2+]І і обернено - від [Сa2+]Е При тестованому потенціалі. Встановлена ж залежність задовільно описується рівнянням Хілла. Це можна пояснити, виходячи з твердження, що за тривалого фіксування мембранного потенціалу внаслідок функціонування Na+-Ca+-обмінника встановлюється термодинамічна рівновага між ДМNa і ДМСa. Якщо припустити, що в умовах поза - і внутрішньоклітинної перфузії ДМNa є досить стабільною величиною, то внаслідок збільшення [Сa2+]Е збільшиться і [Сa2+]І. Тому встановлена залежність вхідного струму Na+-Ca2+-обміну від [Сa2+]Е відображає, по суті, його залежність від [Сa2+]І. Високе значення коефіцієнта N зумовлене, на нашу думку, не стільки здатністю обмінника одночасно транспортувати велику кількість катіонів Са2+, скільки його активацією цими іонами.

Са2+-помпа плазматичної мембрани та ендоплазматичного ретикулуму. Ще однією транспортувальною системою, що забезпечує виведення Са2+ з цитозолю чи не всіх клітин, є Са2+-помпи плазматичної мембрани і ендоплазматичного ретикулуму. Тому наші зусилля були спрямовані на підтвердження наявності Са2+-помпи у секреторних клітинах слинних залоз личинки комара-дергуна, використовуючи метод визначення Са2+, Mg2+-АТФазної активності.

Рівень РН у середовищі, яке містило 0,1 ммоль/л Са2+ і 5 ммоль/л АТФ, після 30 хв інкубації фракції клітинних мембран збільшився і становив 12,46 0,11 мкмоль / мг білка. Під впливом строфантину К він зменшувався на 19,98 1,17% (P < 0,001, n = 16), що свідчить про наявність Nа+, К+-АТФази у плазматичній мембрані клітин слинної залози. Додавання до безкальцієвого середовища інкубації ЕГТА (0,65 ммоль/л) на фоні строфантину К призводило до блокування і Са2+-помп. Розрахована Са2+, Мg2+-АТФазна активність становила 15,94 0,13 мкмоль РН / мг білка за 30 хв (22,88 0,56% від загальної АТФазної активності).

Залежність Са2+, Мg2+-АТФазної активності фракції клітинних мембран досліджуваних залоз від [Са2+] у середовищі має куполоподібний характер з максимумом за наявності у середовищі 0,1 ммоль/л Са2+. Така ж закономірність характерна і для інших Са2+, Mg2+-АТФаз, зокрема плазматичної мембрани еритроцитів людини (Sarkadi, 1980), міометрію корів (Костерин, 1990) та міокарда морських свинок (Курский, Костерин, Воробец, 1987), а також саркоплазматичного ретикулуму скелетних м'язів (Болдырев, 1977).

Еозин Y (10 мкмоль/л) повністю пригнічував Са2+, Мg2+-АТФазну активність фракції клітинних мембран слинних залоз (P < 0,001, n = 6). Са2+, Mg2+-АТФазна активність під впливом бутилгідроксихінону (25 мкмоль/л) зменшувалася на 68,62 9,26% (P < 0,05, n = 6), а під впливом окситоцину (100 мкмоль/л) - на 65,74 13,50% (але P = 0,079, n = 5).

Під впливом еозину Y у концентраціях 1-5 мкмоль/л вміст Са2+ у тканині інтактних слинних залоз суттєво збільшився (Рис. 7), що є підтвердженням наявності у плазматичній мембрані досліджуваних клітин Са2+-помпи. Причому, це збільшення задовільно описується рівнянням Хілла з коефіцієнтом N = 1. Це, на нашу думку, - надзвичайно цікавий факт, оскільки засвідчує, що еозин Y у заданих концентраціях діє лише на одну Са2+-транспортувальну систему.

Ефект еозину Y у концентрації 10 мкмоль/л (Рис. 7), навпаки, є наслідком дії еозину Y не лише на Са2+-помпу плазматичної мембрани, але і Са2+-помпу внутрішньоклітинних депо. Пригнічення цієї Са2+-транспортувальної системи призводить до зменшення акумуляції Са2+, відповідно його вміст у тканині зменшується. Оскільки при цьому пригнічене функціонування і Са2+-помпи плазматичної мембрани, вказане зменшення є відносне.

Внаслідок дії еозину Y у концентрації 20 мкмоль/л на залози, Оброблені сапоніном з метою пермеабілізації плазматичної мембрани, вміст Са2+ у їхній тканині зменшився відносно контролю на 20,27 ± 6,92% (Р < 0,05, n = 17). Тапсигаргін у концентрації 1 мкмоль/л теж зменшував вміст Са2+ у тканині залоз на 40,61 ± 9,91% (Р < 0,05, n = 7). Це є прямим підтвердженням функціонування у внутрішньоклітинних мембранах досліджуваних секреторних клітин Са2+-помпи.

Внутрішньоклітинні канали вивільнення Са2+. Вміст Са2+ у тканині оброблених сапоніном залоз внаслідок додавання до середовища інкубації IФ3 (10 мкмоль/л) зменшився на 41,14 ± 11,75% (Р < 0,05, n = 11). За наявності гепарину (500 мкг/мл) вміст Са2+ у тканині під впливом IФ3 не змінювався. Не змінювався він під впливом ІФ3 і за наявності еозину Y (20 мкмоль/л), який, пригнічуючи Са2+-помпу ендоплазматичного ретикулуму, призводить до спустошення внутрішньоклітинного депо Са2+. Отже, у секреторних клітинах слинних залоз личинки комара, як і в ацинарних клітин підшлункової (Nathanson et al., 1994; Cancela, Van Coppenolle, Galione, Tepikin, 2002), слинних (Lee et al., 1997; Ambudkar, 2000) та шлункових (Дубицький, 2006) залоз вищих тварин, наявні ІФ3-чутливі Са2+-канали.

В ході ідентифікації ріанодинчутливих Са2+-каналів ми з'ясували, що зміни вмісту Са2+ у тканині інтактних слинних залоз та їхня секреторна активність внаслідок додавання до базового розчину кофеїну у концентраціях 1-15 ммоль/л мають складний характер. Спочатку спостерігалося збільшення вмісту Са2+ у тканині та секреції загального білка, яке виявилося найсуттєвішим під впливом кофеїну у концентрації 4 ммоль/л. За вищих концентрацій кофеїну спостерігалося відносне зменшення вмісту Са2+ у тканині залоз.

У присутності бутилгідроксихінону (25 мкмоль/л) і еозину Y (10 мкмоль/л) кофеїн в концентрації 4 ммоль/л спричиняв не збільшення, а зменшення вмісту Са2+ в тканині залоз відповідно на 31,66 ± 4,32 і 62,24 ± 4,51% (P < 0,001, n = 7). Тому ми вважаємо, що збільшення вмісту Са2+ в тканині залоз під впливом низьких концентрацій кофеїну спричинене Або пригніченням Са2+-помпи плазматичної мембрани, або стимуляцією Са2+-помпи ендоплазматичного ретикулуму. Під впливом кофеїну у концентрації 10 ммоль/л зменшення вмісту Са2+ у тканині інтактних залоз виявилося значно суттєвішим на фоні еозину Y і бутилгідроксихінону, ніж у контролі. Отже, кофеїн у високих концентраціях дійсно сприяє вивільненню Са2+ з внутрішньоклітинних депо досліджуваних клітин, інкубованих у базових умовах.

Під впливом ріанодину у концентрації 5 нмоль/л вміст Са2+ у тканині слинних залоз, оброблених сапоніном, Зменшився на 35,18 ± 3,87% (Р < 0,001, n = 13), а у концентрації 500 нмоль/л - Збільшився на 40,72 ± 12,52% (Р < 0,05, n = 7). Зменшення вмісту Са2+ у тканині залоз під впливом ріанодину у низькій концентрації зумовлене, власне, активацією ріанодинчутлих Са2+-каналів і переконливо свідчать про їхню наявність. Мабуть, частина цих каналів при інкубації у контрольному розчині знаходиться у активному стані, оскільки ріанодин у вищій концентрації, спричинив збільшення вмісту Са2+ у тканині.

Отже, у секреторних клітинах слинних залоз личинки комара-дергуна, як і в секреторних клітинах екзокринних залоз вищих тварин (Lee et al., 1997; Di Julio et al., 1997; Zhang et al., 1997; Fitzsimmons et al., 2000; Федірко, 2006) наявні й ріанодинчутливі Са2+-канали, які досить ефективно блокуються ріанодином у субмікромолярних концентраціях.

Са2+-уніпортер мітохондрій. Рутеній червоний (10 мкмоль/л) зменшував вміст Са2+ у тканині інтактних залоз на 28,95 ± 6,70%. Проте за наявності у середовищі еозину Y (5, 10 і 20 мкмоль/л) рутеній червоний практично не змінював вмісту Са2+ у тканині інтактних залоз. З'ясувалося також, що під впливом рутенію червоного за наявності у середовищі інкубації еозину Y (20 мкмоль/л) вміст Са2+ у тканині слинних залоз, Оброблених розчином сапоніну, зменшився на 26,98 ± 9,00% (P < 0,05, n = 7). Швидше за все, це зменшення воно зумовлене впливом рутенію червоного на акумуляцію Са2+ мітохондріями.

Пуринові рецептори. Внаслідок додавання у середовище з фізіологічною [Са2+] АТФ у концентраціях 0,1, 1 і 2 ммоль/л вміст Са2+ у тканині залоз статистично достовірно не змінювався (Рис. 8). Лише за дії АТФ у концентрації 0,01 ммоль/л спостерігалося незначне (на 16,33 ± 6,24%) зменшення вмісту Са2+. Таке ж зменшення збереглося і за підвищеної до 10 ммоль/л [Са2+]E - на 12,93 ± 4,74%. За дії АТФ у вищих концентраціях зміни вмісту Са2+ у тканині залоз, інкубованих у середовищі з підвищеною [Са2+], також не змінювалися відносно контролю. Ми припускаємо, що індуковане АТФ у низькій концентрації зменшення вмісту Са2+ у тканині залоз в обох випадках може бути зумовлене його вивільненням з депо внаслідок активації Р2Y-рецепторів. Вивільнений у цитозоль Са2+ виводиться системами активного транспортування у позаклітинне середовище, тому його сумарний вміст у тканині зменшується. За вищих концентрацій АТФ активує, очевидно, P2X-рецептори, що спричиняє збільшення надходження Са2+ у клітину з позаклітинного середовища. Це і нівелює зменшення Са2+ у тканині залоз, спричинене активацією P2Y-рецепторів.

Зовсім інша картина спостерігалася за інкубування залоз у номінально безкальцієвому середовищі. За цих умов АТФ у всіх зазначених концентраціях спричиняв зниження вмісту Са2+ у тканині залоз (Рис. 8). Причому, за 0,01 ммоль/л АТФ у середовищі інкубування нормалізоване зменшення вмісту Са2+ у тканині виявилося більшим, ніж за наявності у середовищі фізіологічної і підвищеної [Са2+], і становило 29,31 ± 7,30%. Але найпомітніше зниження було під впливом АТФ у концентрації 1 ммоль/л - на 57,93 ± 12,35%. АТФ-стимульоване зменшення вмісту Са2+ у тканині за його відсутності у середовищі переконливо свідчить про наявність у досліджуваних клітинах P2Y-рецепторів.

Внаслідок додавання до ЕГТА-вмісного безкальцієвого середовища АДФ у тих же концентраціях, що й АТФ, ми спостерігали зменшення вмісту Са2+ у тканині залоз. Більше того, спорідненість P2Y-рецепторів досліджуваних клітин до АДФ, як і в епітеліальних клітинах (Yang, 2000), є більшою, ніж до АТФ.

Ще одним підтвердженням наявності у досліджуваних клітинах Р2Y-рецепторів є те, що вміст мембранозв'язаного Са2+ після інкубування у номінально безкальцієвому розчині зменшився під впливом АТФ (0,1 ммоль/л) на 19,6% (Р = 0,018, n = 5).

Отже, зменшення вмісту Са2+ як у тканині залоз, так і мембранозв'язаного зумовлене вивільненням його з ІФ3-чутливого депо внаслідок активації Р2Y-рецепторів. Відсутність змін вмісту Са2+ у тканині залоз у відповідь на дію АТФ у високих концентраціях за наявності Са2+ у середовищі може бути спричинене одночасною активацію P2Y - та Р2X-рецепторів. Тому, на нашу думку, АТФ може виконувати функцію первинного посередника у досліджуваних клітинах.

Похожие статьи